Vitrifikācija nebija viena izgudrojuma. Tā radās, kad pētnieki risināja dažādas problēmas dažādās struktūrās; šūnās, embrijos, orgānos un, galu galā, cilvēka biostāzē.
Mērķis skan vienkārši: atdzesēt ūdeni bagātu audu līdz stikla stāvoklim, neļaujot veidoties kaitīgiem ledumiem.
Izmantot tas nav vienkārši. Krioprotektanti var būt toksiski. To ievadīšana var izkropļot šūnas. Lieli objekti atdziest nevienmērīgi, uzkrāj spriegumu un ir daudz grūtāk atkausēt.
Mūsdienu procedūras līdz ar to ir sistēmas, nevis receptes. To kvalitāte ir atkarīga no ķīmijas, perfūzijas, temperatūras, laika, ģeometrijas un mērījumu savstarpējās saskaņotības.
Pirms vitrifikācijas: aukstums radīja otro traumu
Agrīnajā krioprezervācijā lielākoties nozīmēja sasaldēšanu. Atdzesējot, ķīmiskās reakcijas palēninājās, bet ūdens kristalizējās ledū.
Leds izslēdz sāļus un citas vielas atlikušajā šķidrumā. Šūnas līdz ar to var pieredzēt mehānisko pārvietošanos, ekstremālas vielu koncentrācijas, dehidratāciju un membrānu traumu vienlaicīgi.
Ātrāka atdzesēšana var padarīt kristālus sīkākus, taču parastais ūdens, lai kļūtu par stiklu bez ķīmiskas palīdzības, prasa ārkārtīgi augstus ātrumus. Tas darbojas tikai ļoti plāniem paraugiem.
Vēsturiskā problēma nebija vienkārši sasniegt zemu temperatūru. Tas bija to sasniegt, neļaujot ūdenim reorganizēties kaitīgos kristālos.
Jūs: no 1937 līdz 1938: pirmie kinetiskie vitrifikācijas eksperimenti
Basile Luyet piedāvāja vitrifikāciju kā bioloģiskās saglabāšanas stratēģiju 1937 gadā.
Jūs ziņojāt par kustības atjaunošanu varžu spermai, kas bija pakļauta šķidram gaisam pēc dehidratācijas ar koncentrētu saharozi, darbā “Biostasis Codex” (1938).
oriģinālo eksperimentuoriģinālo eksperimentuatkarīga no mikroskopiskajiem slāņiem un ekstremāli ātrās dzesēšanas. Tas pierādīja fizisku iespējamību, nevis mērogojamu orgānu protokolu.
Šo pieeju tagad dēvē par kinetisko vitrifikāciju: pārspēj kristalizāciju, atņemot siltumu ātrāk, nekā ledus var veidoties un augt.
Mērogs to sagrauj. Virsmas laukums aug lēnāk nekā tilpums, tāpēc lielas parauga centrā nevar sekoja virsmai pietiekami ātri.
1949: glicerīns maina problēmu
Kristofers Poldžs, Odrija Smita un Alans Pārkess atklāja 1949, ka glicerīns var aizsargāt spermatozoīdus zemas temperatūras saglabāšanas laikā.
JūsuNature report pierādīja praktisko nozīmību, ko dziļi iespiešanas krioaizsarglīdzekļiem ir.
Šīs molekulas iekļūst šūnās, saista ūdeni un samazina ledus daudzumu, kas veidojas noteiktā temperatūrā. Tās arī samazina kaitīgo šķīduma koncentrāciju sasalšanas laikā.
Atklājums pārveidoja krio biologiju, jo dzesēšanas ātrums vairs nebija vienīgais kontroles mainīgais. Ķīmiskais sastāvs varēja mainīt ūdens fāzes uzvedību.
Tas arī ieviesa jaunu optimizācijas problēmu. Vairāk krioaizsarglīdzekļu efektīvāk nomāc ledus veidošanos, bet palielina ķīmisko un osmotisko kaitējumu.
1959 līdz 1968: vairāk līdzekļu un pakāpeniska iekļaušana
Jūsu 1959: James Lovelock un Marcus Bishop ziņoja, ka dimetilsulfoksīds aizsargāja vairākus šūnu tipus no sasalšanas kaitējuma.
DMSO šķērsoja dažas membrānas vieglāk nekā glicerīns. Tas paplašināja šūnu klāstu, kuras varēja tikt krioaizsargātas, un joprojām tiek plaši izmantots laboratorijās un klīniskajā krio konservācijā.
John Farrant turpināja pētīt krioaizsarglīdzekļu koncentrācijas palielināšanu, vienlaikus pazeminot temperatūru, uzturot audu koncentrētā šķidrumā bez ledus veidošanas.
Tas paredzēja mūsdienu protokolu pamatā esošu iezīmi: pakāpeniski iekļaut krioaizsarglīdzekļus zemā temperatūrā, nevis vienreizēji pakļaut siltu audu pilnai koncentrācijai.
Pakāpeniska iekļaušana ierobežo osmotisko šoku. Zemāka temperatūra samazina daudzu ķīmisko reakciju ātrumu un var padarīt citādi kaitīgu iedarbību panesamāku.
Jūsu 1968 eksperimenti parādīja, ka sarkanās asins šūnas var sasniegt slāpekļa šķidruma temperatūru bez redzama ledus, ja glicerīna koncentrācija ir pietiekami augsta.
Konceptuālās daļas bija klāt. Kas vēl trūka, bija praktisks veids, kā pielietot tās sarežģītiem, vaskularizētiem audiem.
Jūsu 1984: vitrifikācija kļūst par orgānu stratēģiju
Jūsu 1984 raksts“Vitrification as an Approach to Cryopreservation” pārstrukturēja vitrifikāciju kā nopietnu ceļu orgānu banku izveidei.
Stratēģiju dažreiz dēvēja par līdzsvara vitrifikāciju. Tā vietā, lai prasītu neiespējami ātru dzesēšanu, izmantoja pietiekami daudz krioaizsarglīdzekļu, lai kritiskais dzesēšanas ātrums būtu sasniedzams lielākā sistēmā.
Šis pagrieziens atklāja trīs saistītus ierobežojumus:
- Jums jābūt spējīgam izturēt ledus iedarbību pie sasniedzamiem dzesēšanas un sasilšanas temps.
- Jums jābūt spējīgam panest šķīduma iepildīšanu un izpildīšanu.
- Jums jābūt spējīgam nodrošināt, ka krioaizsargājošais šķīdums sasniedz katru reģionu pirms dzesēšanas sākšanās.
Formulējums var izrādīties izcili labs pārbaudē ar mēģeni, bet neizdoties orgānam, jo vaskulārā pretestība, difūzijas attālums vai toksicitāte maina rezultātu.
1985: dzīvi embriji atgriežas no stikla stāvokļa
William Rall un Gregory Fahy ziņoja parledus brīvu krioaizsardzību peles embrijiem -196°C 1985.
Tas bija lemišķs bioloģisks pierādījums. Dzīvas kodolšķiedras mugurkaulnieku šūnas varēja izdzīvot pēc dzesēšanas un atkausēšanas, pilnībā nonākot stikla stāvoklī.
Embriji joprojām ir mazi. To temperatūra un koncentrācija var mainīties ātri un vienmērīgi salīdzinājumā ar pieauguša orgānu.
Rezultāts apstiprināja metodi, vienlaikus padarot mērogu problēmu redzamāku.
Mēroga problēma sadalās četrās problēmās
1. Krioaizsargājošā šķīduma toksicitāte
Koncentrācija, kas nepieciešama vitrifikācijai, var traucēt olbaltumvielu, membrānu un šūnu metabolismu. Toksicitāte ir atkarīga no vielas, koncentrācijas, temperatūras, iedarbības laika un audu veida.
Tas nozīmē, ka “mazāk toksisks” nav vienas molekulas īpašība. Tas ir pilnā iepildīšanas un izpildīšanas protokola īpašība.
2. Osmotiskais stress
Koncentrēta šķīduma pievienošana izraisa ūdens iziešanu no šūnām. Tā izņemšana var atgriezt ūdeni pārāk ātri.
Mūsdienu protokoli izmanto koncentrācijas rampas, nesējsšķīdumus, temperatūras kontroli un necaurlaidīgus šķīdumus, lai saglabātu tilpuma izmaiņas pieņemamās robežās.
3. Nevienmērīga piegāde
Orgāns nav vienmērīga šķidruma tvertne. Krioaizsargājošais šķīdums pārvietojas caur asiem, šķērso kapilāru sienas un difundē caur audiem.
Asins recekļi, tūska, asinsvadu slimības, išēmija un asins-smadzeņu barjeras var atstāt dažas zonas zem koncentrācijas, kas nepieciešama, lai apspiestu ledus veidošanos.
Tādēļ mūsdienuperfūzija mēra spiedienu, plūsmu, temperatūru un venozo koncentrāciju, nevis balstās tikai uz šķīduma tilpumu.
4. Termiskie gradienti
Liels objekts dzesējas no ārpuses uz iekšpusi. Atšķirīgas temperatūras izraisa atšķirīgus sarukšanas ātrumus.
Tuvojoties un zem stikla pārejas temperatūras, materiāls nespēj ātri atbrīvoties no sprieguma. Ja spriegums pārsniedz tā mehānisko stiprību, var veidoties plaisas.
Šķīdums tika dzesēts ar kontroles ātrumu, atkausēts tuvu Tg un vēlāk lēnāk nolaists caur stikla fāzes apgabalu. Šie principi tagad veidodatoru kontroles cilvēka dzesēšanu.
1990 un 2000: maisījumi aizstāj vienas vielas pieeju
Neviens vienīgais krioprotektants neoptimizēja visas prasības. Pētnieki arvien biežāk kombinēja caurlaidīgus līdzekļus, lai katrs varētu ieguldīt savu daļu, ne sasniedzot savu sliktāko individuālo koncentrāciju.
Pārnesējšķīdumi kontrolēja jonus, pH un osmotiskos apstākļus. Necaurlaidīgie polimēri ietekmēja audu ūdeni un asinsvadu uzvedību.
Sintētiskie ledus blokatori mērķēja heterogēno ledus kodolu veidošanos un augšanu. Tie samazināja atkarību tikai no krioprotektantu koncentrācijas.
Šķīdumi, piemēram, VS55 un vēlāk M22, bija sistēmas inženierijas rezultāts: vairāki līdzekļi, ledus blokatori un rūpīgi izstrādāta pārnesējķīmija, kombinēta ar definētiem perfūzijas un termiskiem protokoliem.
Viens2004 pārskats par orgānu vitrifikāciju apraksta progresu toksicitātes samazināšanā, atdzišanas bojājumu, kodolu kontroli un orgānu perfūziju.
Svarīgākā pārmaiņa nebija tā, ka toksicitāte pazuda. Pētnieki iemācījās sadalīt slogu starp ķīmiju, laiku un temperatūru.
Trusīša nieres eksperimenti: nozīmīgi, bet viegli pārspīlējami
Darba ar trušu nieri pierādīja, ka vaskularizēts zīdītāju orgāns var tikt ielādēts ar kompleksu vitrifikācijas šķīdumu, atdzests līdz stikla stāvoklim, atkausēts un transplantēts.
Viens ziņotais nieres transplantāts nodrošināja trušam vienīgo funkcionējošo nieri ilgstošā periodā.
Šis rezultāts ir nozīmīgs, jo tas pārgāja no mikroskopiskiem paraugiem uz orgāna funkciju. Tas neatklāja uzticamu klīnisko procedūru.
Vēlākā literatūra norāda, ka ilgtermiņa transplantācijas veiksmīgums netika atkārtojams. Distribūcija, toksicitāte un parastā virsmas atkausēšana palika ierobežojoši faktori.
Tas ir pareizais epistēmiskais stāvoklis: nozīmīgs pierādījums principam ar atkārtojamības un mēroga problēmu.
2015: saglabāšanas kvalitāte kļūst redzama sinaptiskā mērogā
Aldehīdu stabilizētā krioprezervācija kombinēja ķīmisko fiksāciju, krioaģentu perfūziju un vitrifikāciju trušu un cūku smadzenēs.
Pētījums2015 ziņoja par skaidrām membrānām, sinapsēm, vezikulām, mielīnu un intracelulārajām struktūrām pēc atkausēšanas un sagatavošanas elektronu mikroskopijai.
Tas pierādīja, ka izcilu nervu ultrastruktūru var saglabāt ledus brīva uzglabāšanas cikla laikā lieliem smadzeņu paraugiem.
Tas nerādīja dzīvotspējīgu atjaunošanu. Aldehīdu fiksācija apzināti savieno bioloģisko materiālu un nav saderīga ar parastiem dzīvas funkcijas atjaunošanas mēģinājumiem.
Eksperiments līdz ar to atbildēja uz struktūras jautājumu, nevis uz pilnīgas atdzīvināšanas jautājumu.
Tā plašākie ieguldījumi bija metodoloģiski: saglabāšana jānovērtē, pārbaudot interesējošās struktūras, nevis vienīgi pēc tam, kad paraugs izskatās stiklotā veidā.
2023: nanosildīšana risina atkausēšanu žurku nierēs
Atdzesēšana ir tikai puse no apgriezeniskas krioprezervācijas. Atkausēšana bieži ir grūtāka.
Ja sildīšana ir pārāk lēna, ledus var veidoties devitrifikācijas laikā. Ja siltums galvenokārt nāk no virsmas, termiskie gradienti var izraisīt orgāna lūzumus.
Nanosildīšana risina abas problēmas, izplatot dzelzs oksīda nanodaļiņas caur asinsvadu sistēmu un sildot tās ar maiņstrāvas radiofrekvences magnētisko lauku.
2023 pētījumā zinātniekivitrificēja žurku nieres, uzglabāja tās līdz 100 dienām, nanosildīja tās un transplantēja.
Atjaunotās nieres nodrošināja dzīvību uzturošu nieru funkciju recipientiem bez savām nierēm pārskatāminā novērošanas periodā.
Šis sasniegums nebija atkarīgs vienīgi no sasilšanas. Komanda pārgāja uz mazāk toksisku formulējumu un modelēja krioaģentu ievadīšanu, lai uzlabotu audu koncentrāciju.
Tas ir atkārtojošs mācību stāsts vitrifikācijas vēsturē: viena šķēršļa pārvarēšana atklāj nākamo, un veiksmīga atjaunošana prasa visu ķēdi.
2024 uz 2026: lielākas fiziskas sistēmas un funkcionāli nervuudi
2024 pētījumā tika ziņotsfiziska vitrifikācija cilvēka orgānu mērogā 0.5 līdz 3 litru sistēmās.
Viņi kombinēja iekšējo termometriju, atkausēšanu, kontroles dzesēšanu un mikro-CT pārbaudi. Viņi arī demonstrēja nanosasilšanu tilpumos līdz 2 litriem.
Lielākie demonstrējumi bija galvenokārt fiziski. Ledus un plaisu novēršana ir nepieciešama, bet tā nenodrošina bioloģisku atjaunošanu cilvēka lieluma orgānam.
2026 pētījumā,PNAS pētījumsziņoja par īslaicīgu funkcionālu atjaunošanos pieauguša peles hipokampa audu pēc vitrifikācijas un atkausēšanas.
Pētījums mērīja morfoloģiju, mitohondriju reaktivitāti, neironu ierosinātspēju, sinaptisko pārraidi un ilgtermiņa potenciāciju.
Tas ietvēra peles smadzeņu šķēlienes un zemproduktīvas visu smadzeņu sagataves, nevis cilvēka smadzenes. Tā nozīme ir šaurāka, bet joprojām būtiska.
Tas parādīja, ka pieauguša zīdītāju nervuudi var atjaunot elektrofizioloģiskas funkcijas pēc molekulārās mobilitātes apstāšanās stikla stāvoklī.
Cilvēka biostāze manto zinātni grūtākos apstākļos
Orgānu glabāšanas eksperimenti sākas ar veselu audu, kontroles laika plānošanu un plānotu piekļuvi asinsvadu sistēmai.
Cilvēka biostāze sākas pēc likumīgās nāves. Slimība, siltā isēmija, tromboze, tūska, transports un asinsvadu slimības var visi traucēt krioaģentu piegādi.
Tūlītējais mērķis ir struktūras saglabāšana iespējamo nākotnes labošanas nolūkā, nevis pašreizēja reversīva transplantācija.
Šis atšķirības iemesls ir tas, kādēļ laboratorijas apgalvojumus nevar tieši pārnest uz pacientu apgalvojumiem.
Kā Tomorrow.bio pielāgoja vitrifikāciju lauka apstākļiem
Tomorrow.bio pārvietoja visu ķermeņa krioprotektīvo perfūziju specializētos ātrās palīdzības auto. Procedūru var sākt netālu no pacienta, nevis gaidot transportu uz Šveici.
Tas maina svarīgu ievadi, ko ķīmija nevar labot: isēmijas apjomu pirms perfūzijas.
Pašreizējais protokols izmanto VM-1-bāzētu šķīduma ķīmiju, kas pielāgota lauka krioprotekcijai un sekojošai sausā ledus transportēšanai.
ViensEBF pētniecības programma ir testējusi VM-1 simulētos pēc nāves apstākļos, ieskaitot trīs stundas ilgu siltu isēmiju.
Programma mērīja venozo refrakcijas indeksu, perfūzijas laiku, svara izmaiņas, smadzeņu sarukšanu un ledus veidošanos, testējot izmaiņas perfuzā un procedūrā.
Šis ir praktiskais cilvēku gadījumu fronte: nevis vai ideāls šķīdums var vitrifikēt, bet gan cik labi reāls isēmiskais pacients var tikt perfundēts.
Mērījumi kļuva par daļu no procedūras
Agrīnajā vitrifikācijas pētījumos panākumi bieži tika noteikti caur caurspīdīgumu, kalorimetriju, rentgena difrakciju, izdzīvošanu vai funkciju pēc atkausēšanas.
Cilvēku biostāze nespēj izmantot atlabšanu kā mūsdienu mērķi. Tādēļ tai ir nepieciešami nedestruktīvi un paraugu ņemšanas veidi, lai novērtētu saglabāšanas kvalitāti.
Tomorrow.bio veic CT skenēšanu katram pacientam vienā un tajā pašā slāpekļa temperatūrā, lai novērtētu krioprotektantu sadalījumu un identificētu ledus vai makroskopiskas defektes standartizētos apstākļos.
Ar atsevišķu piekrišanu, neironu mikroparaugi var atbalstīt elektronmikroskopijas novērtējumu membrānām, sinapsēm un lokālajai ultrastruktūrai.
Šie metodes un to ierobežojumi ir aprakstītibiostasis quality-check procedures.
Mērījumi maina pašu attīstību. Kad kļūda kļūst redzama un salīdzināma starp gadījumiem, ķīmija un protokols var tikt pielāgoti, lai to novērstu.
Kas ir uzlabojies, un kas vēl nav atrisināts
Mūsdienu vitrifikācija ir sasniegusi vairākus rezultātus, ko agrākā sasaldēšana nebija spējusi:
- Ledus brīva daudzu šūnu, embriju un mazu audu saglabāšana.
- Vitrificētu dzīvnieku orgānu funkcionālu atjaunošanu noteiktos eksperimentos.
- Sinaptiskā mēroga struktūras saglabāšanu fiksētos zīdītāju smadzenēs.
- Datorvadītu dzesēšanu un atkausēšanu lielākām sistēmām.
- Tilpumiska atkausēšana ar tehnoloģijām, piemēram, nanokarsēšanu.
- CT un elektronmikroskopijas metodes reāla saglabāšanas rezultātu mērīšanai.
Tā nav nodrošinājusi atgriezenisku cilvēka visu ķermeņa krioprezervāciju.
Paliekošās problēmas ietver pēcnāves išēmiju, nevienmērīgu perfūziju, krioprotektantu toksicitāti, asins-smadzeņu barjeras ietekmi, visu ķermeņa termiskos gradientus, plaisu novēršanu un drošu vienmērīgu atkausēšanu.
Pat veiksmīga struktūras saglabāšana atstātu nākotnes problēmas, kā atjaunošanu, atdzīvināšanu un sākotnējā nāves cēloņa ārstēšanu.
Šīs atšķirības ir attīstītastehniskajos izaicinājumos atgriezeniskai krioprezervācijai.
TL;DR: Vitrifikācija uzlabota ar labākiem krioprotektantiem, perfūziju, ledus kontroli, dzesēšanu, atkausēšanu un struktūras mērīšanu. Dažas problēmas ir atrisinātas mazos mērogos, bet visu cilvēku atgriezeniskā saglabāšana joprojām nav atrisināta.
Izpētiet šo praktisko rīku
Izmantojiet interaktīvo rīku, lai izpētītu šajā rakstā minēto jautājumu.
Interaktīvā rīka ielāde...
Papildu lasāmviela