Vitrifikācija nebija viens izgudrojums. Tā attīstījās pakāpeniski, pētniekiem risinot problēmas, kas saistītas ar šūnām, embrijiem, orgāniem un galu galā arī cilvēka biostazi.
Mērķis skan vienkārši: atdzesēt ūdenī bagātus audus līdz stiklveida stāvoklim, neveidojot kaitīgu ledu.
Īstenošana nav vienkārša. Krioprotektanti var būt toksiski. To iepludināšana var deformēt šūnas. Lieli objekti atdziest nevienmērīgi, tajos uzkrājas spriegumi, un tos ir daudz sarežģītāk sasildīt.
Tāpēc mūsdienu procedūras ir sistēmas, nevis receptes. To kvalitāti nosaka ķīmijas, perfūzijas, temperatūras, laika, ģeometrijas un mērījumu saskaņota mijiedarbība.
Pirms vitrifikācijas: aukstums radīja papildu bojājumus
Agrīnā kriokonservācija lielākoties nozīmēja sasaldēšanu. Atdzesēšana palēnināja ķīmiskos procesus, taču ūdens kristalizējās ledū.
Ledus izspiež sāļus un citas izšķīdušās vielas atlikušajā šķīdumā. Tādēļ šūnas vienlaikus var tikt pakļautas mehāniskai deformācijai, ļoti augstai izšķīdušo vielu koncentrācijai, dehidratācijai un membrānu bojājumiem.
Ātrāka atdzesēšana var veidot mazākus kristālus, tomēr, lai parasts ūdens bez ķīmiskas palīdzības pārietu stiklveida stāvoklī, nepieciešams ārkārtīgi liels atdzesēšanas ātrums. Tas izdodas vien ārkārtīgi plāniem paraugiem.
Vēsturiskā problēma nebija vienkārši zemas temperatūras sasniegšana. Problēma bija sasniegt zemu temperatūru, neļaujot ūdenim veidot kaitīgus kristālus.
1937. līdz 1938. gads: pirmie kinētiskās vitrifikācijas eksperimenti
Basils Liuē (Basile Luyet) 1937. gadā piedāvāja vitrifikāciju kā bioloģiskas konservācijas stratēģiju.
1938. gadā Liuē un Judžīns Hodaps (Eugene Hodapp) ziņoja par kustīguma atjaunošanos vardes spermā, kas pēc dehidratācijas ar koncentrētu saharozi bija bijusi pakļauta šķidram gaisam.
Sākotnējais eksperiments balstījās uz mikroskopiskām plēvēm un ārkārtīgi lielu atdzesēšanas ātrumu. Tas apliecināja procesa fizikālo iespējamību, bet nepiedāvāja orgāniem mērogojamu protokolu.
Šo pieeju tagad sauc par kinētisko vitrifikāciju: siltumu aizvada ātrāk, nekā ledus spēj veidoties un augt.
Palielinot parauga izmēru, šī pieeja vairs nedarbojas. Virsmas laukums palielinās lēnāk nekā tilpums, tāpēc liela parauga centrālā daļa nevar atdzist tikpat ātri kā virsma.
1949. gads: glicerīns maina problēmu
Kristofers Poldžs (Christopher Polge), Odrija Smita (Audrey Smith) un Alans Pārkss (Alan Parkes) 1949. gadā atklāja, ka glicerīns spēj aizsargāt spermatozoīdus zemas temperatūras konservācijā.
Viņu raksts žurnālā Nature nostiprināja šūnās iekļūstošu krioprotektīvu vielu praktisko nozīmi.
Šīs molekulas iekļūst šūnās, saista ūdeni un samazina ledus daudzumu, kas veidojas dotajā temperatūrā. Tās arī samazina kaitīgi augstu izšķīdušo vielu koncentrāciju sasaldēšanas laikā.
Atklājums pārveidoja kriobioloģiju, jo atdzesēšanas ātrums vairs nebija vienīgais kontrolējamais lielums. Šķīduma ķīmiskais sastāvs ļāva mainīt ūdens fāžu pāreju norisi.
Tomēr tas radīja jaunu optimizācijas problēmu. Lielāka krioprotektanta koncentrācija efektīvāk nomāc ledus veidošanos, taču palielina ķīmisku un osmotisku bojājumu risku.
1959. līdz 1968. gads: vairāk vielu un pakāpeniska iepludināšana
1959. gadā Džeimss Lavloks (James Lovelock) un Markuss Bišops (Marcus Bishop) ziņoja, ka dimetilsulfoksīds pasargā vairākus šūnu tipus no sasaldēšanas radītiem bojājumiem.
DMSO caur dažām šūnu membrānām iekļuva vieglāk nekā glicerīns. Tas paplašināja to šūnu klāstu, kuras varēja kriprotektēt, un DMSO joprojām plaši lieto laboratorijās un klīniskā kriokonservācijā.
Pēc tam Džons Farants (John Farrant) pētīja krioprotektanta koncentrācijas pakāpenisku palielināšanu, vienlaikus pazeminot temperatūru, lai audus varētu turēt koncentrētā šķīdumā, izvairoties no ledus veidošanās.
Šis paņēmiens ievadīja mūsdienu protokolu galveno principu: krioprotektantu ievada pakāpeniski un zemā temperatūrā, nevis uzreiz pievieno pilnā koncentrācijā siltiem audiem.
Pakāpeniska iepludināšana ierobežo osmotisko šoku. Zemāka temperatūra samazina daudzu ķīmisko reakciju ātrumu un var padarīt citādi kaitīgu iedarbību paciešamāku.
1968. gadā eksperimenti parādīja, ka pietiekami augstā glicerīna koncentrācijā sarkanās asins šūnas var sasniegt šķidrā nitrogēna temperatūru bez redzama ledus.
Pamatprincipi jau bija zināmi. Tomēr trūka praktiskas metodes, kā šos principus izmantot sarežģītos, ar asinsvadiem apgādātos audos.
1984. gads: vitrifikācija kļūst par orgānu stratēģiju
1984. gada rakstā “Vitrification as an Approach to Cryopreservation” vitrifikācija tika piedāvāta kā nopietna pieeja orgānu ilgstošai uzglabāšanai.
Šo stratēģiju dēvēja arī par līdzsvara vitrifikāciju. Tā vietā, lai paļautos uz praktiski nesasniedzamu atdzesēšanas ātrumu, izmanto pietiekami lielu krioprotektanta koncentrāciju, lai kritiskais atdzesēšanas ātrums būtu sasniedzams arī lielākā sistēmā.
Šī pāreja atklāja trīs savstarpēji saistītus ierobežojumus:
- Šķīdumam jāspēj novērst ledus veidošanos pie praktiski sasniedzamiem atdzesēšanas un sasildīšanas ātrumiem.
- Orgānam jāspēj izturēt šā šķīduma ievadīšanu un izvadīšanu.
- Kriprotektantam jānokļūst katrā audu apgabalā, pirms sākas atdzesēšana.
Formula varēja darboties izcili mēģenē, bet nedot rezultātu orgānā, jo to ietekmē asinsvadu pretestība, difūzijas attālums un toksicitāte.
1985. gads: dzīvi embriji atgriežas no stiklveida stāvokļa
Viljams Rols (William Rall) un Gregorijs Fejhijs (Gregory Fahy) 1985. gadā ziņoja par peļu embriju kriokonservāciju bez ledus veidošanās temperatūrā -196 °C.
Tas bija izšķirīgs bioloģiskais pierādījums. Dzīvas zīdītāju šūnas ar kodolu spēja pārdzīvot atdzesēšanu un sasildīšanu pilnīgi vitrificētā stāvoklī.
Tomēr embriji ir ļoti mazi. Salīdzinājumā ar pieauguša cilvēka orgānu to temperatūra un koncentrācija var mainīties ātri un vienmērīgi.
Rezultāts apliecināja metodes pamatprincipa dzīvotspēju, vienlaikus vēl skaidrāk parādot ar mērogu saistītās problēmas.
Mēroga problēma sadalās četrās problēmās
1. Kriprotektanta toksicitāte
Vitrifikācijai nepieciešamā koncentrācija var traucēt proteīnu, membrānu un šūnu metabolisma darbību. Toksicitāte ir atkarīga no konkrētās vielas, koncentrācijas, temperatūras, iedarbības laika un audu tipa.
Tas nozīmē, ka apzīmējums “mazāk toksisks” nav raksturīgs vienai molekulai izolēti. To nosaka viss ievadīšanas un izvadīšanas protokols.
2. Osmotiskais stress
Koncentrēta šķīduma pievienošana izvelk ūdeni no šūnām. Tā izvadīšana var likt ūdenim ieplūst atpakaļ pārāk ātri.
Mūsdienu protokolos izmanto pakāpenisku koncentrācijas palielināšanu, palīgšķīdumus, temperatūras kontroli un šūnās neiekļūstošas vielas, lai šūnu tilpuma svārstības saglabātu pieļaujamās robežās.
3. Nevienmērīga piegāde
Orgāns nav viendabīgs šķīduma tilpums. Krioprotektants plūst pa asinsvadiem, šķērso kapilāru sieniņas un difundē audos.
Trombi, tūska, asinsvadu slimības, išēmija un hematoencefālā barjera var neļaut dažos audu apgabalos sasniegt koncentrāciju, kas vajadzīga ledus veidošanās novēršanai.
Tāpēc mūsdienu perfūzija mēra spiedienu, plūsmu, temperatūru un venozo koncentrāciju, nevis paļaujas vienīgi uz šķīduma tilpumu.
4. Termiskie gradienti
Liels objekts atdziest no ārpuses uz iekšu. Dažādas temperatūras rada dažādu saraušanās ātrumu.
Stiklošanās pārejas temperatūras (Tg) tuvumā un zem tās materiāls nespēj ātri atbrīvot spriegumus. Ja spriegums pārsniedz materiāla mehānisko izturību, var veidoties plaisas.
Risinājums bija atdzesēšana ar kontrolētu ātrumu, atkvēlināšana Tg tuvumā un lēnāka temperatūras pazemināšana stiklveida pārejas apgabalā. Šie principi tagad tiek izmantoti datorvadītā cilvēka ķermeņa atdzesēšanā.
1990. gadi un 2000. gadi: vienas vielas vietā sāk izmantot maisījumus
Neviens atsevišķs kriprotektants nespēja optimāli izpildīt visas prasības. Pētnieki arvien biežāk sāka kombinēt šūnās iekļūstošas vielas, lai katra sniegtu savu ieguldījumu, nesasniedzot tai individuāli visbīstamāko koncentrāciju.
Palīgšķīdumi kontrolēja jonu, pH un osmotiskos apstākļus. Šūnās neiekļūstoši polimēri ietekmēja ūdens apriti audos un asinsvadu reakciju.
Sintētiskie ledus veidošanās inhibitori kavēja heterogēnu ledus nukleāciju un kristālu augšanu. Tie samazināja nepieciešamību izmantot ļoti augstu krioprotektanta koncentrāciju.
Tādi šķīdumi kā VS55 un vēlāk M22 iemiesoja sistēminženierijas pieeju: tajos apvienotas vairākas vielas, ledus veidošanās inhibitori, rūpīgi izstrādāta palīgšķīdumu ķīmija, kā arī noteikti perfūzijas un siltuma režīmi.
2004. gada pārskatā par orgānu vitrifikāciju aprakstīti sasniegumi toksicitātes mazināšanā, aukstuma bojājumu novēršanā, nukleācijas kontrolē un orgānu perfūzijā.
Svarīgākais sasniegums nebija toksicitātes pilnīga novēršana. Pētnieki iemācījās samazināt toksisko slodzi, līdzsvarojot ķīmisko sastāvu, iedarbības laiku un temperatūru.
Trušu nieru eksperimenti: nozīmīgi un viegli pārspīlējami
Trušu nieru pētījumi apliecināja, ka vaskularizētu zīdītāju orgānu var iepludināt ar sarežģītu vitrifikācijas šķīdumu, atdzesēt stiklveida stāvoklī, sasildīt un transplantēt.
Vienā aprakstītā gadījumā niere, būdama vienīgā funkcionējošā niere, ilgāku laiku uzturēja truša dzīvību.
Šis rezultāts ir svarīgs, jo pētījums pārgāja no mikroskopiskiem paraugiem uz visa orgāna funkcijas izvērtēšanu. Tomēr tas neradīja uzticamu klīnisku procedūru.
Vēlākā literatūra norāda, ka ilgtermiņa transplantācijas panākumus nebija izdevies atkārtoti sasniegt. Ierobežojošie faktori joprojām bija nevienmērīga vielu izplatīšanās, toksicitāte un parastā sasildīšana no virsmas.
Pašreizējais zināšanu stāvoklis ir šāds: tas ir nozīmīgs principa pierādījums, taču ar atkārtojamības un mēroga problēmām.
2015. gads: konservācijas kvalitāte kļūst redzama sinapses mērogā
Aldehīdā stabilizēta kriokonservācija apvienoja ķīmisku fiksāciju, kriprotektanta perfūziju un vitrifikāciju trušu un cūku smadzenēs.
2015. gada pētījums ziņoja par skaidrām membrānām, sinapsēm, vezikulām, mielīnu un šūnu iekšējām struktūrām pēc sasildīšanas un sagatavošanas elektronu mikroskopijai.
Tas parādīja, ka lielās smadzenēs bez ledus veidošanās var saglabāt ļoti labu neironālās ultrastruktūras kvalitāti visā uzglabāšanas ciklā.
Tas neapliecināja funkcionālu atveseļošanos. Aldehīda fiksācija apzināti veido šķērssaites bioloģiskajā materiālā un nav savietojama ar parastu dzīvu funkciju atjaunošanu.
Tāpēc eksperiments atbildēja uz strukturālu jautājumu, nevis uz pilnu atdzīvināšanas jautājumu.
Tā plašākā nozīme bija metodoloģiska: konservācijas kvalitāte jāvērtē, tieši pārbaudot konkrētās interesējošās struktūras, nevis tikai konstatējot parauga stiklveidīgu izskatu.
2023. gads: nanosildīšana atrisina sasildīšanas problēmu žurku nierēs
Atdzesēšana ir tikai viena daļa no atgriezeniskas kriokonservācijas. Sasildīšana bieži ir sarežģītāka.
Ja sasildīšana notiek pārāk lēni, ledus var augt devitrifikācijas laikā. Ja siltums nāk galvenokārt no virsmas, termiskie gradienti var izraisīt orgāna plaisāšanu.
Nanosildīšana palīdz risināt abas problēmas: dzelzs oksīda nanodaļiņas ievada asinsvadu sistēmā un sasilda ar mainīgu radiofrekvences magnētisko lauku.
2023. gadā pētnieki vitrificēja žurku nieres, uzglabāja tās līdz 100 dienām, nanosildīja un transplantēja.
Atjaunotās nieres aprakstītajā novērošanas periodā nodrošināja dzīvību uzturošu nieru funkciju recipientiem, kuriem nebija pašu nieru.
Panākums bija saistīts ar vairāk nekā tikai sasildīšanu. Komanda pārgāja uz mazāk toksisku formulu un modelēja kriprotektanta iepludināšanu, lai uzlabotu tā koncentrāciju audos.
Vitrifikācijas vēsturē šī atziņa atkārtojas vairākkārt: atrisinot vienu kritisko problēmu, atklājas nākamā, un veiksmīgai atjaunošanai jādarbojas visiem procesa posmiem.
2024. līdz 2026. gads: lielākas fizikālās sistēmas un funkcionējoši neironālie audi
2024. gadā pētnieki ziņoja par fizikālu vitrifikāciju cilvēka orgāna mērogam atbilstošās sistēmās no 0,5 līdz 3 litriem.
Viņi apvienoja iekšēju termometriju, atkvēlināšanu, kontrolētu atdzesēšanu un mikro-CT pārbaudi. Viņi arī demonstrēja nanosildīšanu tilpumos līdz 2 litriem.
Lielāko paraugu demonstrācijās galvenokārt vērtēja fizikālos rādītājus. Redzama ledus un plaisu novēršana ir nepieciešama, taču tā neapliecina cilvēka mēroga orgāna bioloģisku atveseļošanos.
2026. gadā PNAS pētījums ziņoja par pieaugušas peles hipokampa audu īstermiņa funkcionālu atveseļošanos pēc vitrifikācijas un sasildīšanas.
Pētījumā tika mērīta morfologija, mitohondriju reaģētspēja, neironu uzbudināmība, sinaptiskā pārvade un ilglaicīga potenciācija.
Pētījumā izmantoja peļu smadzeņu griezumus un neliela apjoma veselu smadzeņu preparātus, nevis cilvēka smadzenes. Tā nozīme ir ierobežota, tomēr būtiska.
Pētījums parādīja, ka pieaugušu zīdītāju neironālie audi pēc vitrificēšanas un sasildīšanas var atjaunot elektrofizioloģiskās funkcijas, lai gan stiklveida stāvoklī molekulārā kustība ir apstājusies.
Cilvēka biostazē šīs zinātniskās atziņas jāpiemēro daudz grūtākos apstākļos
Orgānu uzkrāšanas eksperimenti sākas ar veseliem audiem, kontrolētu laika grafiku un plānotu piekļuvi asinsvadu sistēmai.
Cilvēka biostazes procedūras sākas pēc juridiski konstatētas nāves. Slimība, siltā išēmija, trombu veidošanās, tūska, transportēšana un asinsvadu slimības var traucēt krioprotektanta piegādi.
Tuvākais mērķis ir strukturāla konservācija iespējamai vēlākai atjaunošanai, nevis šodienas atgriezeniska transplantācija.
Tieši šīs atšķirības dēļ laboratorijas rezultātus nevar tieši attiecināt uz pacientiem.
Kā Tomorrow.bio pielāgojis vitrifikāciju procedūrām uz vietas
Tomorrow.bio veic visa ķermeņa krioprotektīvo perfūziju specializētās ātrās palīdzības automašīnās. Procedūru var sākt pacienta tuvumā, nevis gaidīt transportēšanu uz Šveici.
Tas ietekmē svarīgu procesa sākotnējo nosacījumu, ko šķīduma ķīmija nevar kompensēt: laiku, cik ilgi audi pirms perfūzijas atrodas išēmijā.
Pašreizējā protokolā izmanto uz VM-1 balstītu šķīdumu, kas pielāgots krioprotekcijai uz vietas un turpmākai transportēšanai sausajā ledū.
EBF pētniecības programma ir testējusi VM-1 simulētos pēcnāves apstākļos, tostarp pēc trīs stundu siltās išēmijas.
Programma mērīja venozo refrakcijas indeksu, perfūzijas laiku, svara izmaiņas, smadzeņu saraušanos un ledus veidošanos, vienlaikus testējot perfūzāta un procedūras izmaiņas.
Tā ir galvenā praktiskā problēma cilvēka biostazē: svarīgi ir ne vien tas, vai ideāls šķīdums spēj vitrificēties, bet arī tas, cik labi iespējams perfundēt audus pacientam ar išēmisku bojājumu.
Mērījumi kļuvuši par procedūras sastāvdaļu
Agrīnajos vitrifikācijas pētījumos panākumus bieži apliecināja ar caurspīdīgumu, kalorimetriju, rentgenstaru difrakciju, izdzīvošanu vai funkciju pēc sasildīšanas.
Cilvēka biostazē atjaunošanos pašlaik nevar izmantot kā kvalitātes mērauklu. Tāpēc nepieciešamas nedestruktīvas un paraugu atlases mērījumu metodes, ar kurām novērtēt konservācijas kvalitāti.
Tomorrow.bio veic katra pacienta CT skenēšanu vienādā šķidrā slāpekļa temperatūrā, lai standartizētos apstākļos novērtētu krioprotektanta izplatību un konstatētu ledu vai lielus defektus.
Ar atsevišķu piekrišanu no neironu audiem iegūti mikroparaugi var tikt izmantoti membrānu, sinapšu un lokālās ultrastruktūras novērtēšanai elektronu mikroskopijā.
Šīs metodes un to ierobežojumi aprakstīti sadaļā “Biostazes kvalitātes pārbaudes procedūras”.
Mērīšana maina pašu attīstības procesu. Kad kļūme ir redzama un salīdzināma dažādos gadījumos, ķīmisko sastāvu un protokolu var mērķtiecīgi pielāgot konkrētās problēmas novēršanai.
Kas ir uzlabojies un kas nav atrisināts
Mūsdienu vitrifikācija ir panākusi vairākas lietas, kas agrīnajai sasaldēšanai nebija sasniedzamas:
- Bezledus konservācija daudzām šūnām, embrijiem un maziem audiem.
- Noteiktos eksperimentos panākta vitrificētu dzīvnieku orgānu funkcijas atjaunošanās.
- Sinapšu mēroga struktūru saglabāšana fiksētās zīdītāju smadzenēs.
- Datorvadīta lielāka apjoma sistēmu atdzesēšana un atkvēlināšana.
- Tilpuma sasildīšana, izmantojot tādas tehnoloģijas kā nanosildīšana.
- CT un elektronu mikroskopijas metodes faktisko konservācijas rezultātu novērtēšanai.
Tomēr tas nav ļāvis panākt atgriezenisku visa cilvēka ķermeņa kriokonservāciju.
Atrisināmās problēmas ietver pēcnāves išēmiju, nevienmērīgu perfūziju, kriprotektanta toksicitāti, hematoencefālās barjeras efektus, visa ķermeņa termiskos gradientus, plaisu novēršanu un drošu vienmērīgu sasildīšanu.
Pat veiksmīga struktūru saglabāšana neatrisinātu nākotnes problēmas, kas saistītas ar audu atjaunošanu, atdzīvināšanu un sākotnējā nāves cēloņa ārstēšanu.
Šīs atšķirības izklāstītas sadaļā “Tehniskie izaicinājumi atgriezeniskas kriokonservācijas ceļā”.
Kopsavilkums: Vitrifikācijas metodes uzlabojās, attīstoties krioprotektantiem, perfūzijai, ledus veidošanās kontrolei, atdzesēšanai, sasildīšanai un struktūru mērīšanas metodēm. Dažas problēmas ir atrisinātas mazā mērogā, taču visa cilvēka ķermeņa kriokonservācijas atgriezeniskums joprojām nav panākts.
Izpētiet šo praktisko rīku
Izmantojiet interaktīvo rīku, lai izpētītu šajā rakstā minēto jautājumu.
Notiek interaktīvā rīka ielāde...
Papildu lasāmviela